Bicinchoninic acid (BCA )法是近來(lái)廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。其原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu²⁺絡(luò)合并將Cu²⁺還原成Cu¹⁺。BCA與Cu¹⁺結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562 nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。與Lowery法相比，BCA蛋白測(cè)定方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，試劑及其形成的紫蘭色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小。與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。

特點(diǎn):

• 靈敏度高：最低可檢測(cè)出25 μg/ml，0.5 μg蛋白
• 線性范圍廣：線性范圍在25 ~2500 μg/ml
• 快速簡(jiǎn)便：45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowry法快4倍而且更加方便
• 兼容性強(qiáng)：不受樣品中去垢劑等化學(xué)物質(zhì)的影響
• 穩(wěn)定性好：蛋白間檢測(cè)變異系數(shù)遠(yuǎn)小于Bradford法

【注意事項(xiàng)】

1、如果檢測(cè)效果不佳，可以室溫放置 2h 或 60℃放置 30min，顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷加深。

   顯色反應(yīng)也會(huì)隨溫度升高而加快；如果濃度較低，可以適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間或在較高溫度下孵育。

2、測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加吸光度或顏色沒(méi)有明顯變化，可能的原因是樣品中

   含有嚴(yán)重干擾 BCA 法測(cè)定蛋白濃度的物質(zhì)。

3、BCA 法檢測(cè)中樣本中不應(yīng)含有 EDTA，否則影響檢測(cè)結(jié)果。

4、因 BCA 法測(cè)定時(shí)顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷加深，建議每次測(cè)定時(shí)都做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且顯色

   反應(yīng)的速度和溫度有關(guān)，所以除非精確控制顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度，否則每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5、如果沒(méi)有酶標(biāo)儀，也可以使用普通分光光度計(jì)測(cè)定，但應(yīng)考慮根據(jù)比色皿的最小檢測(cè)體積。

   應(yīng)按比例適當(dāng)加大 BCA 工作液的用量使總體積不小于最小檢測(cè)體積，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的用量亦

   相應(yīng)按比例放大；使用分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度時(shí)，可以測(cè)定的樣品數(shù)量可能會(huì)顯著減少。

6、為了加快 BCA 法測(cè)定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)加熱，但是切勿過(guò)熱，否則易失效。

7、為保證蛋白的精確定量，樣品的提取和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的配制最好選用相同的緩沖液，同時(shí)也要保證

   兩者檢測(cè)條件的一致性。如果緩沖液本身就有較高的背景值，建議使用其他的方法測(cè)定。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的蛋白濃度